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本文目錄一覽：

• 1、pcr中為什么以c dna為模板而不是以dna為模板
• 2、PCR技術(shù)的原理是什么?
• 3、PCR技術(shù)基本原理
• 4、利用PCR擴(kuò)增目的基因，那模板是和目的基因有關(guān)嗎?

pcr中為什么以c dna為模板而不是以dna為模板

因?yàn)閮蓚€(gè)模板顯示出形式不一樣

做的時(shí)候一般是提取植物總的RNA，然后采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，主要是獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)，判斷目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)量的變化。因?yàn)橹苯犹崛NA的話，并不能證明該基因在其他細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)這種方法可以克服假陽(yáng)性

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)簡(jiǎn)稱PCR技術(shù)，是一種在DNA聚合酶作用下體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便，可在短時(shí)間獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異的目的DNA序列的拷貝。80年代中期PCR技術(shù)的發(fā)明，引起了生物技術(shù)發(fā)展的一次革命，目前已被廣泛應(yīng)用于與分子生物學(xué)相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域。

PCR技術(shù)的原理是什么?

PCR技術(shù)的基本原理：

該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。

在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

PCR技術(shù)的應(yīng)用：

PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和β-地中海貧血的基因突變開(kāi)始的。

PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在，PCR就可以檢測(cè)到。

PCR技術(shù)不但能有效的檢測(cè)基因的突變，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。

PCR技術(shù)基本原理

PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單，以原來(lái)的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國(guó)PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。

這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來(lái)的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。

利用PCR擴(kuò)增目的基因，那模板是和目的基因有關(guān)嗎?

PCR合成的時(shí)候當(dāng)然不只是需要引物，模板鏈也就是目的基因片段是必須的。

因?yàn)镈NA聚合酶合成DNA時(shí)只能從一段已有的DNA片段往上加脫氧核苷酸延伸子鏈，而不能從頭合成，所以需要一段引物。引物就是目的基因在5'段的一小段序列，在于模板鏈結(jié)合后，Taq酶對(duì)其延伸完成復(fù)制。

所以說(shuō)模板不僅僅是和目的基因有關(guān)，應(yīng)該其本身就是或含有目的基因。

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