大家好，我是浮浮~

最近有小伙伴說純生信不好發(fā)了，審稿人要求補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，但是所在醫(yī)院沒有實(shí)驗(yàn)室，qPCR和WB都做不了，馬上就要進(jìn)職稱了，沒有文章硬傷啊，怎么辦？

今天帶來的這篇文章 “APOE Is a Prognostic Biomarker and Correlates with Immune Infiltrates in Papillary Thyroid Carcinoma”是2022年3月發(fā)表的生信文章，沒有做基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，也沒有自己收集臨床組織樣本，而是購買了組織芯片，加了一點(diǎn)點(diǎn)臨床信息和免疫組化的結(jié)果就成功發(fā)表，我們一起來看一下吧。

期刊介紹

復(fù)現(xiàn)過程

接下來我們打開生信分析神器：仙桃工具，開始對本文進(jìn)行復(fù)現(xiàn)。進(jìn)入仙桃學(xué)術(shù)主頁：https://www.xiantao.love/

點(diǎn)擊“生信工具”

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【高級版】 → 【立即使用】（注：免費(fèi)版和基礎(chǔ)版都可以進(jìn)行統(tǒng)計和可視化，由于高級版功能最全，這里選擇高級版作為范例）。▼

首先我們來復(fù)現(xiàn)表達(dá)差異的結(jié)果，原文作者分析了主變量分子在泛癌中的表達(dá)情況，采用了非配對的形式，這樣顯示的癌種更多一些。在工具左側(cè)菜單欄“表達(dá)差異（挑）”模塊進(jìn)入，選擇“表達(dá)差異”菜單，工具提供了“非配對樣本”和“配對樣本”兩種選擇，我們來分別看一下。

原文使用了非配對，我們這里展示一下配對樣本，點(diǎn)擊進(jìn)入頁面后，首先選擇“泛癌”疾病數(shù)據(jù)集，向右拖拽可以看到正常vs腫瘤，或者癌旁vs腫瘤，前者是納入了GTEx中的正常樣本數(shù)據(jù)。進(jìn)行分析時可以兩個都試一下，如果結(jié)果都比較好，可以像本文一樣都展示出來。

這里納入的都是TCGA中的樣本，格式有TPM和FPKM兩種（兩個TPM格式的數(shù)據(jù)是相同的）。這兩種格式都有很多參考文獻(xiàn)支持，建議優(yōu)先選擇TPM格式，但是如果FPKM格式的結(jié)果較好，展示這種也是可以的。如果想分析miRNA，就選擇miRNAseq數(shù)據(jù)。

右側(cè)參數(shù)部分輸入分子，這里輸入“APOE”，點(diǎn)擊“確認(rèn)”進(jìn)行繪圖。

我們可以看到結(jié)果部分有甲狀腺癌的結(jié)果，并且在腫瘤中表達(dá)高于正常對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義。如果這里沒有大家研究的疾病，也可以不展示配對結(jié)果。

接下來我們看一下非配對樣本形式，操作也是相同的，并且仙桃工具具有記憶疾病和分子的功能，進(jìn)入“非配對樣本”模塊后，疾病和分子都是選好的，直接點(diǎn)擊“確認(rèn)”即可。這里建議選擇GTEx的正常樣本配對，樣本數(shù)目多，而且得到的結(jié)果會比較好看一些。

這里說明一下非配對的樣本，TCGA-GTEx的數(shù)據(jù)，納入了正常組織的配對樣本，由于TCGA中都是癌旁的樣本，這一點(diǎn)在“臨床資料”這列也可以看出來。第二行和第三行都是TPM格式的TCGA數(shù)據(jù)，但是來源不同，XENA-TCGA是XENA數(shù)據(jù)庫中的泛癌樣本，TCGA-ALL是直接從TCGA獲取的數(shù)據(jù)，自己分析的時候兩個都是可以的，只要在寫文章的時候注明數(shù)據(jù)來源。最后兩行就不多啰嗦了，一個是FPKM格式，最后一行是miRNA的數(shù)據(jù)。

結(jié)果這里提供多種格式進(jìn)行下載，“保存結(jié)果”可以上傳到歷史記錄中，可直接用于后續(xù)拼圖，重復(fù)上述操作可以得到正常vs腫瘤和癌旁vs腫瘤的結(jié)果。好用的拼圖功能已經(jīng)多次詳細(xì)展示了，這里就不再重復(fù)了，還不會的小伙伴可以關(guān)注“挑圈聯(lián)靠”公眾號，查看之前的推文，有詳細(xì)操作過程~

說明一下源代碼問題，有小伙伴說有些雜志要求提供代碼，這一點(diǎn)我們也是考慮到了的。在高級版權(quán)限下，結(jié)果部分最后的demo.R就是核心代碼，投稿上傳是足夠了的，不過只有高級版提供哦。

接下來作者分析了主變量在THCA中的表達(dá)差異情況，這里以非配對為例，疾病選擇THCA，右側(cè)參數(shù)中分子輸入“APOE”，點(diǎn)擊“確認(rèn)”即可。

比原文中的顯著性還高，并且是習(xí)慣性的正常對照放在左邊，個人感覺看起來比原文的還舒服一些。右側(cè)參數(shù)還可以選擇其它類型的圖形進(jìn)行展示，并且可以調(diào)整結(jié)果圖片的參數(shù)，鼠標(biāo)點(diǎn)一點(diǎn)就能夠輕松實(shí)現(xiàn)，方便不撞車。

如果自己研究的疾病具有配對樣本，想要同時展示配對結(jié)果也是可以的。作者使用了HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）展示了免疫組化的結(jié)果。這部分雖然是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是也算是生信挖掘，建議大家能夠自己收集樣本做一下免疫組化。

進(jìn)入數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)，在首頁面輸入分子名稱，點(diǎn)擊“Search”

一般第一條就是目標(biāo)基因，點(diǎn)擊“Tissue”

在左側(cè)欄的“TISSUES”中找到目標(biāo)組織

點(diǎn)擊圖片可以看到該組織染色的詳細(xì)信息

在上方點(diǎn)擊“Pathology”獲取APOE在腫瘤中的免疫組化圖像

還是左側(cè)欄點(diǎn)擊“CANCER”，選擇“THYROID CANCER”

點(diǎn)擊圖片進(jìn)入就可以看到放大結(jié)果和該片子的詳細(xì)信息。鼠標(biāo)放在圖片上右鍵即可另存為本地文件。

接下來分析了主變量分子的臨床相關(guān)性。原文作者使用了UALCAN數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析可視化，這里我們來看一下仙桃如何獲得更好看、更個性化的結(jié)果吧。

在“臨床意義”分組下，第一個就是“臨床相關(guān)性”

頁面看起來復(fù)雜，但也都是通過鼠標(biāo)點(diǎn)一點(diǎn)完成的。主要在下方選擇相應(yīng)的臨床指標(biāo)和分類，點(diǎn)擊“確認(rèn)”即可出圖。

原文圖片中代表統(tǒng)計意義的星號是后期AI/PS處理的，使用仙桃可以直接得到帶有統(tǒng)計指標(biāo)的結(jié)果圖片，在右側(cè)參數(shù)“統(tǒng)計分析”中，可以選擇顯示的組別以及顯示類型。

仙桃的自動配色已經(jīng)非常好看了，如果大家想要更加個性化的結(jié)果，也可以選擇其它配色方案。

相關(guān)的臨床指標(biāo)每一種癌癥都是不完全相同的，也有一些與癌癥特點(diǎn)相關(guān)的個性化指標(biāo)，操作都一樣，大家根據(jù)疾病特點(diǎn)選擇即可。

接下來是經(jīng)典的KM生存分析曲線，仍然在“臨床意義”中，下拉“預(yù)后分析”選項(xiàng)，點(diǎn)擊“KM曲線圖”進(jìn)入模塊。

由于工具可以記憶上一次分析的疾病和分子，所以該頁面點(diǎn)進(jìn)去時不需要更改任何內(nèi)容，直接點(diǎn)擊“確認(rèn)”出圖，非常方便快捷~

在右側(cè)“預(yù)后參數(shù)”中可以選擇“預(yù)后類型”，繪制不同類型的KM曲線圖。

這里有個細(xì)節(jié)，之前分析中APOE在腫瘤組表達(dá)升高，而在這里APOE作為一種保護(hù)因素，高表達(dá)APOE反而獲得了較高的預(yù)后生存率，之前也有學(xué)員分析自己課題的時候出現(xiàn)這樣的情況，感興趣的小伙伴可以閱讀一下原文，看下作者是如何解釋的，以后如果自己遇到這種情況，就可以模仿作者的解釋，或者將這篇文獻(xiàn)引用，回應(yīng)審稿人的質(zhì)疑。

我們繼續(xù)復(fù)現(xiàn)文章。接下來作者繪制了ROC曲線，這時使用了組織芯片的臨床數(shù)據(jù)和免疫組化結(jié)果，這里只展示了典型圖片。組織芯片的數(shù)據(jù)我們無法復(fù)現(xiàn)，ROC曲線還是能夠輕松實(shí)現(xiàn)的。

在“臨床意義”模塊中點(diǎn)擊“ROC曲線”進(jìn)入。這里有兩個，另一個是“ROC曲線-自選變量”，我們一會也來看一下。

仍然是進(jìn)入后點(diǎn)擊“確認(rèn)”即可，如果想要更加個性化的圖片，可以在右側(cè)參數(shù)中進(jìn)行調(diào)整，之前也介紹過，而且參數(shù)的調(diào)整也是完全通過點(diǎn)鼠標(biāo)完成的，非常簡便，這里就不贅述了。

接下來我們看一下“ROC曲線-自選變量”

比剛才的ROC曲線多了一個臨床變量，其實(shí)也很好理解，比如選擇臨床的狀態(tài)，以正常和腫瘤組織分組，點(diǎn)擊“確認(rèn)”。

可以看到其實(shí)和剛才的結(jié)果是一樣的，因?yàn)槟J(rèn)的ROC曲線就是以Normal和Tumor分組的。不過這里可以選擇其它臨床特征的變量，大家在分析自己研究的疾病時候可以多試一些變量，挑選結(jié)果比較好的進(jìn)行展示。

接下來是免疫浸潤分析，作者使用了TIMER和TISIDB數(shù)據(jù)庫來分析免疫浸潤，而我們使用仙桃工具就可以了，還能得到風(fēng)格統(tǒng)一的結(jié)果。在“交互網(wǎng)絡(luò)”中，展開“免疫浸潤”分析，可以看到有三種可視化形式，我們一起來看一下。

仍然是自動選擇疾病和分子，直接點(diǎn)擊“確認(rèn)”出圖，我們來看一下。

這樣棒棒糖圖就做好了，可以看到該目的基因的確與各種免疫細(xì)胞都有比較高的相關(guān)性，而且都是正相關(guān)，接下來我們重點(diǎn)看一下右側(cè)參數(shù)可以調(diào)整的風(fēng)格。

個人比較喜歡的是橫向的棒棒糖圖，這個主要看拼圖時候的布局。在“風(fēng)格”中取消“XY軸顛倒”，并將“X軸文本翻轉(zhuǎn)角度”設(shè)置為“45”，最后調(diào)整到比較合適的圖片大小即可。

最后得到的結(jié)果如下。橫向和縱向都出現(xiàn)過文章中，所以這個完全是個人習(xí)慣和圖片布局，對于結(jié)果并沒有很大的影響，大家可以自由選擇。

接下來是分組比較圖，就在棒棒糖圖的下方，點(diǎn)擊進(jìn)入，在右側(cè)“參數(shù)”中的“類型”可以選擇箱式圖、小提琴圖等類型。“算法參數(shù)”下方可以選擇細(xì)胞種類，如果這里同時選了幾種細(xì)胞，就可以在同一張圖片中展示分組結(jié)果。

在風(fēng)格和圖片中調(diào)節(jié)風(fēng)格和圖片大小，小伙伴們趕快動手實(shí)操試一下吧。

接下來我們看一下“散點(diǎn)圖”。進(jìn)入后疾病和分子不變，在“算法參數(shù)”中的“細(xì)胞”可以選擇多種免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，這里以T細(xì)胞為例。

這里可以分析多個細(xì)胞類型，保存結(jié)果，然后使用仙桃工具的拼圖工具進(jìn)行拼圖，非常方便。

原文作者使用了TISIDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析了主變量在泛癌中與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。這里不推薦大家這樣分析，因?yàn)殚_始的泛癌表達(dá)差異到后面的甲狀腺癌可以看作是由大到小的聚焦，這里突然又進(jìn)行泛癌的分析，反而讓邏輯混亂了。這里作者之所以使用泛癌，可能是因?yàn)樵摂?shù)據(jù)庫無法調(diào)整某個單一的癌種，所以作者只能這樣做，而且可以看到，得到的圖片非常模糊，所以我們還是使用仙桃工具輕松搞定。

在“交互網(wǎng)絡(luò)”中，下拉“分子相關(guān)性分析”，點(diǎn)擊“單基因共表達(dá)熱圖”進(jìn)入。

備注：這里的（臨時）是指為了學(xué)員更好地體驗(yàn)仙桃工具，我們對基礎(chǔ)版臨時開放的部分高級版權(quán)限模塊，已經(jīng)購買高級版的學(xué)員不用擔(dān)心，模塊不會取消的，并且以后更新的模塊也都是免費(fèi)使用的，不再另外收費(fèi)~

這步相對來說會比較麻煩一點(diǎn)點(diǎn)，因?yàn)橐诜肿恿斜碇休斎敕治龅姆肿用Q，大家可以參考原文，輸入原文的基因名稱進(jìn)行分析。

這樣得到的結(jié)果美觀清晰，而且邏輯還不突兀，仍然是單個癌種的分析。大家可以分別嘗試原文中另外三組標(biāo)志物，四張圖片拼一張figure，也很好看。

本文到此就復(fù)現(xiàn)結(jié)束了，邏輯比較清晰，以生信為主，購買了組織芯片，這樣既不需要補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，也不用自己收集臨床標(biāo)本，為大家又提供了一種性價比很高的方式。而且我在網(wǎng)上查了一下，還有泛癌的組織芯片，十幾種癌癥類型，每種3-7例樣本，大家可以咨詢一下當(dāng)?shù)氐墓荆矛F(xiàn)在補(bǔ)充表達(dá)差異的結(jié)果還能夠發(fā)文章，組織芯片算是很好的選擇了。

最近小伙伴們總說生信文章發(fā)不出去了，做生信沒有用啦。這個觀點(diǎn)個人是不贊同的，生信文章越來越難發(fā)我承認(rèn)，畢竟有了仙桃這樣的工具，入門的門檻降低后，發(fā)表的門檻必然升高。但是內(nèi)卷是必然的，未來的要求只會越來越高，如果現(xiàn)在不抓住機(jī)會趕緊分析趕緊發(fā)表，那么一段時間之后，僅僅補(bǔ)充表達(dá)差異實(shí)驗(yàn)的文章也發(fā)不出去了，可能多數(shù)雜志就要求補(bǔ)功能表型的實(shí)驗(yàn)了。

所以希望大家不要焦慮，而是能夠抓緊開始，趕上這趟末班車，也祝愿大家都能夠早日發(fā)表自己的生信文章，更多的教學(xué)內(nèi)容大家可以參照往期的復(fù)現(xiàn)推文，也可以加入我們的生信訓(xùn)練營，包括但不限于基礎(chǔ)班訓(xùn)練營、高級版訓(xùn)練營、文章復(fù)現(xiàn)訓(xùn)練營、分模塊教學(xué)的快閃營、寫作工具訓(xùn)練營等等，還有現(xiàn)在雪球老師正在進(jìn)行的生信培訓(xùn)，從生信小白到生信高手的成長之路，感興趣的小伙伴千萬不要錯過啦~

— END—

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